慢病毒包装与纯化平台

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  • 2018-01-20 星期六
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中科蓝华


慢病毒载体简介

慢病毒(Lentivirus)载体是以I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础发展起来的载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较长期的表达,进过改良的慢病毒载体能够感染多种宿主细胞。本平台目前使用安全的第三代慢病毒包装体系,慢病毒具有“自杀”特性,病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。包膜蛋白也使用疱疹性口腔炎病毒G蛋白(Vesicular Stomatitis Virus-G protein, VSV-G),包装的假型病毒具有高感染性,可用于CAR-T细胞制备以及细胞系改造。

慢病毒载体包装

贴壁HEK 293T细胞质粒瞬时转染是慢病毒载体的生产的一种方法,能使慢病毒载体的生产变得简单和节约时间。本慢病毒平台使用PEI作为瞬时转染试剂,四质粒包装慢病毒,慢病毒生产步骤简单。根据实验和生产要求,能够提供多达1L慢病毒载体原液,获得的慢病毒载体滴度高达106 TU/mL - 107TU/mL。

针对收获的慢病毒载体原液,本平台以开发出可行的纯化解决方案,可对慢病毒载体进行80 - 100倍浓缩纯化,得到滴度高达108 TU/mL - 109 TU/mL的高纯度慢病毒载体。



◎ 慢病毒载体质控

慢病毒载体需要符合cGMP标准大规模生产时,必须要对制备的慢病毒载体制定出一定的规格标准,加以控制。参考了不同慢病毒生产公司,欧洲药品管理局和美国FDA对于基因治疗的质量要求以及中国、美国、欧洲药典,本慢病毒平台制定出了符合临床级慢病毒载体要求相关的内部质控标准。此质控标准包括慢病毒载体有效性、安全性、纯度等方面,细化为16条相关检测和评估,对于慢病毒载体的质量要求达到或高于大部分慢病毒载体生产企业,为我们的慢病毒载体生产、浓缩纯化提供了目标和依据。



◎ 慢病毒稳转细胞株

慢病毒载体由于其特性,可感染多种细胞,转入的基因能够在细胞内长期稳定表达,是构建稳转细胞株的重要工具。本平台通过慢病毒载体以成功构建十几株稳转肿瘤细胞,如mCherry-LUCHepG2、GPC3-LUC Hep1-6 细胞系等。说明:

1. 提供宿主细胞系(若非常见细胞,并附详细细胞培养流程)或告知需构建的细胞系。  2. 多克隆细胞跟单克隆细胞均是稳定表达细胞系,可以根据自己实验要求,选择是使用多克隆细胞或者更加纯化的单克隆细胞。      3. 鉴定方法:标准使用q P C R鉴定,也可以使用流式细胞术、ELISA、Western Blot等鉴定方法,所需抗体或试剂盒由客户提供。  

4. 稳定性测试:构建完成的细胞系要进行稳定性测试5-10代,对细胞的生长速率、活率、产量等进行分析。